استفاده از زیست آزمون برای ارزیابی کیفیت آبهای مختلف.
این روش شامل تعیین عمل مواد سمی بر جاندار‌هایی که بصورت خاص انتخاب شده‌اند، در شرایط استاندارد با ثبت تغییرات در سطوح رفتاری، فیزیولوژیکی، سلولی و زیرسلولی می‌باشد. یک آزمون ریزهسته‌ای و فرمول آرنت Arneth به عنوان یک نشانگر زیستی برای مجموعه بهینه مورد استفاده برای تعیین تغییرات خاص ساختاری و عملکردی در ژنوم سلول ناشی از اثرات سمی پیشنهاد شده‌اند.
توجه خاصی به ارزیابی خطر آن عوامل و زیرماده‌ها برای سلامت انسان شد، سمیت ژنی و سمیت سلولی آنها را میتوان با استفاده از نشانگرهای زیستی گیاه و سلول‌های حیوانی شناسایی کرد.
پیش‌گفتار
قابلیت‌های منظم برای بررسی سمیت زیرماده‌های مختلف بر جاندار‌های آزمون، طی بیست سال گذشته گستردگی زیادی پیدا کرده است. جستجوی شدید برای حساس‌ترین موضوعات آزمون و شاخص ها در راه است، روش‌های تحلیلی ابزاری توسعه‌یافته‌اند، تکنیک‌های مختلفی برای ارزیابی کیفیت واسط آبی ، ارتعاش پارامترهای سیستم‌های فیزیولوژیکی و وضعیت زیست شیمی جاندار‌های آزمون بکار رفته است.
زیست آزمون نشان دهنده یک کنترل زیستی است که استفاده هدفمند از جاندار‌های استاندارد آزمون و روش‌هایی برای تعیین درجه سمیت واسط آبی بر اساس سنجش واکنش آزمون جاندار، کارکرد یا سیستم انتخابی آن پیشنهاد می‌دهد.
داده‌های بدست آمده توسط نویسندگان پس از بررسی‌های مختلف نشان داد که زیست آزمون در سطوح جانداری و سلولی را میتوان در صورت اقتضا، برای ارزیابی یکپارچه کیفیت واسط آبی بکار برد. معیار مربوطه برای چنین ارزیابی میتواند شاخص‌های استاندارد بقا، رشد و بازتولید جاندار‌های تست حیوانی و گیاهی و همچنین پارامترهای ساختاری (برحسب آزمون ریزهسته‌ای) و کارکردی (برحسب فرمول آرنت) سلول‌های آنها باشد.
استفاده از زیست آزمون‌های اثرات مواد سمی بر جاندار‌های زیستی (جاندار‌های آزمون گیاهی و حیوانی) و نشانگرهای زیستی سلولی آنها برای کنترل هدفمند و یکپارچه افزایش دائمی تعداد زنوبیوتیک‌های آلوده کننده واسط آبی بسیار مهم هستند، اکثریت آنها بوسیله استانداردهای موجود تنظیم نشده‌اند، با این حال می‌توانند باعث اثرات مختلف سمی، سمیت سلولی، سمیت ژنتیکی یا ژن دو طرفه شوند.
عمومیت سازماندهی سلولی فرصت‌های گسترده‌ای را برای بررسی‌های سم‌شناسی با استفاده از گروه‌های مختلف حیوانات و گیاهان با برون‌یابی بعدی نتایج بدست آمده از سلول‌ها و جاندار انسانی فراهم میکند.
مشکلات زیست آزمون نمونه‌های آب در سطح سلولی با جزییات کافی در مقالات پوشش داده شده‌اند. مقالات خاص در مورد بررسی‌های انجام شده در سطوح زیرسلولی و مولکولی بودند، که آزمایش‌ها آنقدر پر زحمت و پرهزینه بودند که کاربرد عملی گسترده از آنها را محدود میکند. هدف این بررسی تعریف و اثبات بهینه‌ترین راهکارها برای سادگی و عمومیت فنی در بررسی کیفیت نمونه‌های آب در سطوح جانداری و بخصوص سلولی است.
چنین بررسی‌هایی ضروری هستند، زیرا تعداد کل ترکیبات شیمیایی در محیط به بیشتر از 75 میلیون رسیده است. آنها مزایای زیادی برای تحلیل فیزیکی شیمیایی دارند که اغلب به ما اجازه نمی‌دهد ترکیبات ناپایدار را شناسایی کرده یا غلظت‌های بسیار پایین مواد سمی جانداری را به صورت کمیتی تعیین کنیم. در همان حال، زیست آزمون از ارزیابی یکپارچه و سریع سمیت اطمینان می دهد.
در بررسی‌های ما، راهکار یکپارچه اشاره دارد به اینکه انواع مختلف سمیت در سطح جانداری و سلولی بررسی شده‌اند. در نتیجه، به ارزیابی یکپارچه‌ای از عمل سمی دست می‌یابیم. بطور مشخص، واکنش‌های نمونه‌های گروه‌های سیستماتیک مختلف و سطوح تغذیه‌ای (سمیت حاد و مزمن) را میتوان در سطح جانداری و تغییرات ساختاری و کارکردی ژنوم (سمیت ژنی و سلولی) را میتوان در سطح مولکولی بررسی کرد.
مجموعه زیست آزمون‌های زیر برای تحلیل اثر زیر ماده‌های سمی در نمونه‌های آب بر جاندار و سلول‌های آن انتخاب شد:
پیاز
آلیوم سپا Allium cepa
گندم
تریتیکام Triticum
کاهو
لاکتوکا ساتویا Lactuca sativa
خیار
کیوکیومیس ساتیوس (گیاه) (Cucumis sativus (plants
مار آبی
ضعیف کردن مار آبی
دافنیا daphnia
سریودافنیا آفینیس (بی‌مهرگان) (Ceriodaphnia affinis (invertebrates
دانیو رریو (جنین ماهی) (Danio rerio (fish embryos
حیوانات مهره‌دار :
ماهی
داریو رریو Dario rerio
ماهی کپور،
سیپرینوس کارپیو crucian carp
کپور زرد
کاراسیوس آوراتوس گیبلیو Carassius auratus gibellio
قورباغه‌های پنجه‌ای شکل
زنوپوس Xenopus
مجموعه معیارهای سلولی شامل کسری از سلول‌ها با ریزهسته و هسته غیرمعمولی (ثبت مشکلات ساختاری در دستگاه ژنتیکی سلول) و خصوصیات کمیتی لوکوسیت‌های خونی blood leukocytes پیرامونی (تغییرات کارکردی) می‌باشد. شاخص میتوتیک Mitotic index (تغییرات در کسر تقسیم کردن سلول‌ها به عنوان فاکتوری از سمیت سلولی) و تعداد سلول‌های دو هسته‌ای و سلول‌هایی با اختلالات هسته‌ای (عوامل سمیت ژن) در سلول‌های ریشه‌ای گیاهان شناسایی شدند.
تعداد آزمایشات برای شناسایی مسموم کننده‌ها در انواع مختلف آب‌ها (کلرزدایی شده، آب شیر، بسته‌بندی، و آب شهری) برای مقایسه داده‌های بدست آمده از تمام جاندار‌های زنده و گیاهان با آنهایی که در حیوانات خون گرم و همچنین لمفوسیت انسانی human lymphocyte وجود دارند، انجام شد.
موش‌ها جزو حیوانات اصلی آزمایش در تحقیقات زیست‌شناسی و پزشکی هستند. ما اثر انواع مختلف آب بر جاندار‌ها، اعضای انتخابی و سلول‌های خونی موش‌های آزمایشگاهی ویستار Wistar و همچنین بر فعالیت ژنتیکی دوگانه را با استفاده از آزمون القای ناهنجاری‌های کروموزومی در لمفوسیت خون انسان در مولکول‌ها بررسی کردیم.
عوامل هماتولوژیکی جاندار‌های زنده شاخصی از شرایط فیزیولوژیکی جاندار و یکی از معیارهای اصلی تعیین آلودگی آب آشامیدنی هستند (استاندارد DSTU 7387:2013)
نتایج تجربی
آزمایش‌ها با استفاده از آب شهری، آب بسته‌بندی (هومانا) و آب شیر (کلرزدایی شده) انجام شد. آب کنترل در شرایط آزمایشی مطابق با پیشنهادات استاندارد DSTU 4174:2003 اکراین آماده شد.
برای ارزیابی سلولی ژنتیکی بر اساس عوامل هماتولوژیکی ما از خون ماهی، قورباغه، موش و سلول انسانی استفاده کردیم. نمونه خون برای علامت‌گذاری برای آماده‌سازی لکه استفاده شد که تا 96% محلول اتانول پایدار شده بود با استفاده از روند لکه دار کردن رومانوفسکی جیمسا Romanowsky_Giemsa خشک و لکه‌دار شد (25 دقیقه).
تحلیل آماده‌سازی سلولی در شرایط میکروسکوپی نوری (با بزرگنمایی 1000) و تعداد سلول‌ها با ریزهسته‌ای و دو هسته‌ای در گروه‌های کنترل و آزمون تعیین شد. سپس، مقدار ریز هسته‌ای و دو هسته‌ای مقایسه شد. تعداد سلول‌های تحلیل شده برای هر موجود (شخص) بالغ بر 3000 بود. تحلیل آماری با روش‌های استاندارد انجام شد. اثر سمی (سمیت) بر شرایط با تفاوت معنادار آماری برای گروه کنترل معتبر در نظر گرفته شد. برای سمیت سلولی در بخش‌های مختلف لکه، ما 250 سلول را شمارش کرده، آنها را با دسته‌بندی و شناسایی کردیم و سپس درصد هر نوع سلول را ارزیابی کردیم.
نتایج و بحث
زیست آزمون و تحلیل سلول شناسی نمونه‌های آب مورد بررسی انجام شد. ارزیابی‌های سمیت سلولی و ژنی انواع مختلف آب ها ( شهری، بسته‌بندی و آب شیر کلرزدایی شده) بر اساس سلول‌های خون جاندار‌های آزمون و سلول لمفوسیت‌های انسانی در جدول آورده شده‌اند.
همانطور که از داده‌های بدست آمده میتوان دید، برحسب آزمون ریز هسته‌ای و خصوصیات کمیتی لمفوسیت‌ها، واکنش ماهی مشابه پستاندارانی از جمله انسان است. به همین دلیل است که پیشنهاد میشود از ماهی برای نظارت بر مواد بالقوه خطرناک برای انسان‌ها استفاده شود که میتواند باعث معلولیت و سرطان شود، و همچنین همانگونه که محافظان مواد سمیت ژنی مسیر خود را به آب آشامیدنی می‌یابند.
این مساله با ضرایب همبستگی بین شاخص‌های بدست آمده در مورد ماهی و در لمفوسیت خون انسانی تقویت میشود. مقادیر حاصل از ضرایب همبستگی خطی نشان دهنده به هم وابستگی تقریبا تمام شاخص های تعیین شده در مورد ماهی و کمیت متافازهای انحرافی معیوب با فعالسازی متابولیک است.
تولید ریز هسته‌ای و قطعه قطعه شدن کروموزوم‌ها اغلب در فرایند توسعه بیماری آنکولوژیکی رخ می‌دهد، در صورت ابتلا به ویروس، آلودگی باکتریایی، و همچنین در صورتی که سلول‌ها در معرض تابش یونی و ژن‌های دوگانه مختلف قرار بگیرد. همبستگی پایدار تعداد متافازهای انحراف‌های معیوب با فعالسازی متابولیکی بین شاخص‌های تعیین شده‌ی لمفوسیت خون انسانی و شاخص های متناظر روی پیاز تعیین شد.
تغییرات ریخت‌شناسی که سلول‌ها در زمان عمل مسمومیت متحمل میشوند را میتوان با استفاده از بررسی میکروسکوپی شناسایی کرد (شکل1).
ارزیابی مقایسه‌ای آب تحت بررسی براساس سلول‌های خونی
شکل 1: نمونه‌های آماده‌سازی سلول‌شناسی خون یاخته‌ای با اختلالات ساختاری هسته‌ای اریتروسیت: اریتروسیت‌های خون ماهی گروه کنترل (a) ، همچنین گروه آزمون با ریزهسته‌ها (b) ، اریتروسیت خون قورباغه گروه کنترل (c ) ،همچنین گروه آزمون با دو هسته و با هسته قطعه‌‌بندی (d).
ارزیابی سمیت سلولی نمونه‌های آب شامل بررسی اثر مواد سمی بر جاندار‌های آزمون (ماهی) یعنی روی سلول‌های خون لوکوسیت‌ها بود. در تعیین سمیت سلولی واسط آبی، عناصر شکل گرفته ماهی (لوکوسیت‌ها) بعنوان یک نشانگر زیستی استفاده شدند و تعداد لوکوسیت‌ها توسط نرخ نمونه‌های کنترل و آزمون آنها تعیین شد.
لوکوسیت‌ها نقش بسیار مهمی در محافظت جاندار‌ها از کارهای سمی، عفونت‌های باکتریایی و قارچی دارند. رشد تعداد نوتروفیل‌ها در خون، پاسخ جاندار به عمل مسموم‌کننده‌ها، عفونت‌های باکتریایی و بسیاری دیگر است. بروز لیمفوپنیا (کاهش تعداد لمفوسیت‌ها) برای مرحله اولیه عفونت عادی است، فرایند سمی و مرتبط با انتقال از رگ‌ها به بافت در ناحیه متورم است.
کار مسموم‌کننده‌ها بر جاندار‌ها با تغییرات در ترکیبات کمیتی نوتروفیل‌ها تایید شده است. بررسی‌های میکروسکوپی برای تعیین سمیت سلولی در واسط آبی انجام شد (شکل 2).
شکل 2. نمونه آماده‌سازی سلول‌شناسی خون یاخته‌ها، موش‌ها و انسان‌ها که برای تعیین سمیت سلولی واسط آبی استفاده شده‌اند: لمفوسیت‌های خونی ماهی (a) ، همچنین قورباغه (b) ، همچنین موش‌ها (c ) ، همچنین انسان‌ها (d).
ارزیابی کمیتی لوکوسیت‌ها را میتوان به عنوان یک نشانگر زیستی از ترکیب سلولی جاندار استفاده کرد. تعیین سمیت سلولی نمونه‌های آب شامل بررسی اثر مواد سمی بر خون، یعنی بر لوکوسیت‌های خون بود. عناصر شکل‌گرفته (لوکوسیت‌ها) ماهی بعنوان یک نشانگر زیستی استفاده شدند، در این مورد کمیت آنها محاسبه شد و سمیت سلولی واسط آبی بوسیله نرخ لوکوسیت‌ها در نمونه‌های کنترل و آزمون ارزیابی شد. این روش از نظر فنی ساده، به سرعت قابل اجرا، ارزان، به سادگی قابل ارزیابی کمیتی، و بقدر کافی آموزنده است.
بنابراین، ماهی یک گونه بسیار سازمان‌یافته است که در مقایسه با سایر موارد آزمون، جایگاه بالاتری در زمینه اکولوژی دارد. از آنجایی که ماهی در آب زندگی میکند، چرخه زندگی و واکنش‌های شیمیایی آن در جاندار سریعتر از سایر مهره‌داران است، که ماهی برحسب ارگان‌ها و سیستم‌ها نزدیک است (قورباغه‌ها، موش‌ها، خرگوش‌ها و پرندگان).
عمومیت سازماندهی سلولی ماهی، فرصت‌های گسترده‌ای برای بررسی‌های سم شناسی برای برون‌یابی بعدی نتایج بدست آمده از سلول و جاندار انسان فراهم میکند. در این بررسی ما از روش سلول ژنتیک (آزمون ریز هسته‌ای) برای مشخص کردن تغییرات ساختاری و کمیتی اجزای حیاتی هسته سلولی (کروموزم‌ها و ژن‌ها) استفاده کردیم که حاملان اطلاعات ژنتیکی هستند. تا به امروز مساله اینکه آیا تولید ریز هسته ای نقشی حیاتی در تولید سرطان دارد، همچنان مشخص نیست. در هر صورت ریز هسته شاهدی بر ناپایداری ژنومی هستند.
تعیین کیفیت آب آشامیدنی با استفاده از روش‌های زیست آزمون ، باعث بوجود آمدن یک سری موارد مهم در خصوص برون یابی نتایج بدست آمده برای مثال برای جاندار‌های انسانی شده که آیا داده‌های مسمومیت نمونه‌های آب بدست آمده با استفاده از جاندار‌های آزمون حیوانی و گیاهی نیز سیگنال خطرناکی برای انسان‌ها است. بررسی های بالا می‌توانند انتقال صحیح نتایج بدست آمده در سطح سلولی به سطوح بالاتر سازمان را اطمینان دهند.
روش‌های ارزیابی ژنتیک دوگانه، سمیت ژن و سلولی قابل پذیرش‌ترین برای برون‌یابی برای جاندار‌های انسانی است، یعنی اثرات زیرسلولی و سلولی. این نتیجه‌گیری براساس نتایج چندین برنامه بین‌المللی (ژن تاکس، برنامه بین‌المللی در مورد ایمنی شیمیایی (IPCS)) است که در دهه 1990 انجام شده است. هر تغییری در ساختارهای سلولی گیاهان، بطور مشخص پیاز (آلومیا سپا)، عواقب سمیت ژنی و ژن دوگانه برای حیوان‌های بالاتر از جمله انسان‌ها دارد.
بیش از 10000 ماده شیمیایی اکنون در کارخانه اروپایی مواد شیمیایی تجاری موجود (EINECS) ثبت شده‌اند. از این مقدرا تنها 40-30 ماده بصورت منظم در مورد وجود و غلظت آنها در مهمترین اکوسیستم‌های کشورهای اروپایی آزمون شده‌اند. بخاطر نبود روش های تحلیل مناسب یا هزینه بالای چنین تحلیل‌هایی، بخش مهم مواد را نمی‌توان در آبهای طبیعی و فاضلاب‌ها تعیین کرد.
نتیجه‌گیری
استفاده از شاخص‌های هماتولوژیکی جاندار‌های ماهی، نشان داده که پتانسیل خوبی در زیست آزمون دارد. خون به عنوان یکی از مهمترین سیستم‌های جاندار نقش مهمی در فعالیت حیاتی خود دارد.
به دلیل شبکه به خوبی توسعه یافته مویرگ‌های خونی، با سلول‌های تمام بافت‌ها و ارگان‌ها تماس برقرار کرده و تنفس و تغذیه آنها را اطمینان می‌بخشد. خون در تماس تنگاتنگ با بافت‌ها، دارای تمام خصوصیات واکنشی بافت‌ها می‌باشد، حساسیت آن به تحریکات پاتولوژیکی بالاتر و دقیق‌تر است در حالیکه واکنش آن گران‌تر است است و بهتر تعریف شده است.
به همین دلیل است که تمام انواع واکنش‌ها در بافت‌های جاندار بر ترکیب و خصوصیات خون اثر می‌گذارند. بررسی‌های هماتولوژیکی نشان دهنده بروز نخستین نشانه‌های درهم فرایند پاتولوژیکی است.
تولید عناصر شکل‌گرفته و تخریب آنها در وضعیت تعادل در خون حیوانات و انسان‌ها در شرایط نرمال فیزیولوژیکی جاندار است. اختلال به هم وابستگی بین این فرایندها با واکنش جاندار به تحریک سمی یا طبیعت عفونت تعیین شده است که خود را در تغییر ترکیب کمیتی سلول‌های خونی نشان می‌دهد.
روش های لیست شده در این بررسی متناظر با الزامات مدرن مشخص شده برای بررسی‌های کیفیت نمونه‌های آب است. آنها خصوصیات بیولوژیکی خود را در سطوح زیرسلولی و سلولی تعیین میکنند، تغییرات را در دستگاه ارثی ثبت کرده و بطور واقعی عواقب دور اثرات خود را مشخص میکنند. تغییرات ساختاری و کمیتی سلول‌ها و هسته‌ای را میتوان حتی در غلظت‌های پایین مسموم‌کننده‌ها بصورت نشان داده شده در مقاله مشاهده کرد.
مانیتور زیستی آبهای طبیعی و آشامیدنی یک مشکل موضوعی در مرحله مدرن توسعه جوامع است که توسط تیم‌های پژوهشی در کشورهای بسیاری در سرتاسر دنیا در دست اقدام است.
تحلیل‌های شیمیایی طی تعیین کیفیت آب آشامیدنی کاملا توجیه نشده، زیرا روش‌های شیمیایی نمیتواند مجموعه کامل عناصر موجود در محلول آبی را شناسایی کند و نمیتواند تعامل و تبدیل آنها در واسط و جاندار را ارزیابی کند. زیست آزمون شامل استفاده از مجموعه‌های بهینه‌ای از جاندار آزمون‌ها است و پارامترهای سلولی خصوصیت عینی از مولفه بیولوژیکی کیفیت آب فراهم میکنند.
شما می توانید مقالات تخصصی آب ، تصفیه آب و دستگاه تصفیه آب را در سایت بهاب دنبال کنید.
REFERENCES 1. Archipchuk, V.V. and Goncharuk, V.V., J. Water Chem. and Technol., 2004, vol. 26, no. 4, pp. 48–53. 2. Goncharuk, V.V. and Vergolyas, M.R., Patent 97199 (Ukraine), 2012, Byul., no. 1. 3. Boltina, I.V., Vergolyas, M.R., Poviakel, L.I., Zlatskii, I.A., Zavalna, V.V., Kovalenko, O.V., Makarov, O.O., Zayets, Ye.R., and Semenova, A.Yu., Materialy IX zyizda ukr. tovstva genetykiv selektsioneriv im. M.I. Vavilova (Proceedings of the IX Congress of Ukr. Society of Geneticists – Plant Breeders named after M.I. Vavilov), c. Alushta, 24–28 September 2012, vol. 4, pp. 249–250, Kiev: LOGOS, 2012. 4. Albertini, R.J., Anderson, D., Douglas G.R., et al., Mutat. Res., 2000, pp. 111–172. 5. Pavanello, S. and Clonfero, E., Ibid., 2000, pp. 285–308. 6. Standard DSTU 7387:2013. Yakist vody. Metod vyznachennia tsyto ta genotoksychnosti vody i vodnykh rozchyniv na klitynakh krovi prisnovodnoi ryby Danio rerio (HamiltonBuchanan) (Water Quality. The Method for Determining the Cyto and Genotoxicity of Water and Aqueous Solutions Using Blood Cells of Freshwater Fish Danio rerio (HamiltonBuchanan)), Introduced in 2013. 7. Vergolyas, M.R., Lutsenko, T.V., and Goncharuk, V.V., Tsitologiya i Genetika, 2013, no. 1, pp. 44–49. 8. Boltina, I.V., Author’s Certificate 23794 (Ukraine), 2008, Byul., no. 6. 9. Goncharuk, V.V., Vergolias, M.R., and Boltina, I.V., J. Water Chem. and Technol., 2013, vol. 35, no. 5, pp. 426–435. 10. Fiskejo, G., Hereditas, 1985, vol. 102, pp. 99–112. 11. Goncharuk, V.V. and Vergolias, M.R., J. Water Chem. and Technol., 2014, vol. 36, no. 1, pp. 46–50. 12. Goncharuk, V.V., Boltina, I.V., and Vergolyas, M.R., Patent 201000606 (Ukraine), 2011, Byul., no. 6. 13. Goncharuk, V.V., Vergolyas, M.R., and Boltina, I.V., Patent 95717 (Ukraine), 2011, Byul., no. 16. 14. Inoue, A., Yokomori, K., Tanabe, H., et al., Int. J. Cancer., 1997, pp. 1070–1077. 15. Archipchuk, V.V. and Goncharuk, V.V., J. Water Chem. and Technol., 2001, vol. 23, no. 5, pp. 531–544. 16. Postel, S., State of the World 1987, New York: W.W. Norton, 1987. 17. Standard DSTU 7527:2014. Voda pytna. Vymogy ta metody kontroliuvannia yakosti (Potable Water. Requirements and Methods of Quality Control), Introduced in 2014.
